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LUMEX毛細管電泳儀應用--CIEF方法測定人血清蛋白與干擾素α-2b融合蛋白的等電點

背景介紹


利用人血清白蛋白融合技術,制備一種在體內半衰期長,生物學活性高的長效研究重組人血清白蛋白.干擾素α2b融合蛋白,可用于病毒性肝炎,腫瘤等相關疾病的治療.重組人血清白蛋白‐干擾素α2b融合蛋白是一種新型、長效、具有抗病毒、抗腫瘤及免疫調節作用的細胞因子银河彩票|手机app下载,其半衰期較天然的干擾素α2b長且干擾素抗體的產生時間相對較晚,在臨床上對患者的耐受性及依從性都較天然的干擾素α好。目前一些公司的同類生物制品已經進行到Ⅲ期臨床試驗階段相應的質量控制方法和質量標準都有報道。

本次實驗使用的樣品為康寶集團客戶提供的三個批次的重組人血清蛋白與干擾素α-2b融合蛋白樣品(編號:rIFNα-2b-HAS 20161101、 rIFNα-2b-HSA 20161102、 rIFNα-2b-HSA 20161203)银河彩票|手机app下载银河彩票|手机app下载,主要進行等電點的測定實驗银河彩票|手机app下载银河彩票|手机app下载。

1.實驗條件


儀器:LUMEX Capel 205 毛細管電泳儀

試劑:ADVANCED CIEF STARTER KIT試劑盒,Sciex 公司生產(試劑盒包含涂層的毛細管,pI 標記物和CIEF凝膠)银河彩票|手机app下载。

毛細管條件:長度42 cm银河彩票|手机app下载银河彩票|手机app下载,內徑 50 um,特殊涂層。

分析波長:280 nm

分析電壓:25 kV

分析溫度:20℃

分析時間:70 min

實驗試劑:蒸餾水银河彩票|手机app下载、200 mM 磷酸银河彩票|手机app下载银河彩票|手机app下载、300 mM 氫氧化鈉银河彩票|手机app下载、350 mM 乙酸、500 mM 精氨酸、200 mM 亞氨基二乙酸、3.75 M 尿素-Cief凝膠、尿素溶液和兩性電解質 (Pharmalyte? 3-10)银河彩票|手机app下载。


2.實驗過程

實驗時,首先進行毛細管的沖洗银河彩票|手机app下载,對于本次使用的特殊的涂層毛細管不能用氫氧化鈉等緩沖液沖液银河彩票|手机app下载,需要用水、凝膠進行沖洗和活化。具體的試劑類型如下圖所示:       



進口端和出口端溶液的放置

毛細管的潤洗和分析程序如下圖所示:


毛細管的潤洗程序


分析條件


3.實驗結果及分析

按照上述分析條件進行分析,在分析完成后會得到兩張譜圖,一張為聚焦的譜圖,一張為分析的譜圖,分析和定量主要是通過分析譜圖银河彩票|手机app下载。在本次實驗中主要采用了三種pI marker 5.5银河彩票|手机app下载,9.5 10進行添加作為標準,對于第一批次的樣品rIFNα-2b-HAS 20161101,分析圖譜如下所示:

圖中35min 左右的峰為pI為9.5 的marker的峰银河彩票|手机app下载,51min左右的峰為pI為7.0 的marker的峰, 61 min左右的峰為5.5的marker的峰。三個marker出峰都比較明顯银河彩票|手机app下载,其中的第三個峰為樣品的峰,遷移時間約為56 min左右。

通過第一批次三個marker 的遷移時間和pI值繪制標準曲線,曲線如下:

對于第一批的樣品,通過對樣品蛋白的積分,確定其保留時間并通過公式計算蛋白的pI值為6.05-6.14,其中最大峰的pI值為6.05。

對于第二批次的樣品rIFNα-2b-HAS 20161102,分析圖譜如下所示:

圖中33min左右的峰為pI 為9.5的marker的峰,50min左右的峰為pI 為7.0 的marker的峰, 59min左右的峰為5.5的marker的峰。三個marker出峰都比較明顯,其中的第三個峰為樣品的峰,遷移時間約為55 min左右。

通過第二批次三個marker 的遷移時間和pI值繪制標準曲線,曲線如下:

對于第二批的樣品,通過對樣品蛋白的積分,確定其保留時間(54.6、55银河彩票|手机app下载、55.4 min)并通過公式計算蛋白的pI值為6.02-6.15,其中最大峰的pI值為6.02。

對于第三批次的樣品rIFNα-2b-HAS 20161203,分析圖譜如下所示:

圖中34 min 左右的峰為pI 為9.5 的marker的峰,51 min 左右的峰為pI 為7.0 的marker的峰, 60 min左右的峰為5.5的marker的峰。三個marker出峰都比較明顯,其中的第三個峰為樣品的峰,遷移時間約為55 min左右银河彩票|手机app下载。

通過第二批次三個marker 的遷移時間和pI值繪制標準曲線,曲線如下:

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對于第三批的樣品银河彩票|手机app下载,通過對樣品蛋白的積分银河彩票|手机app下载银河彩票|手机app下载,確定其保留時間(56.5、56.9、57.3 min)并通過公式計算蛋白的pI值為6.03-6.15,其中最大峰的pI值為6.03。

為了確認是否在5.5與4.1之間是否有其他的蛋白,將5種標記物都配制走樣,圖譜如下:

結果發現,在此條件下未出現明顯的其他雜質蛋白,說明蛋白相對較純。



              來源:LUMEX分析儀器


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